劉妍 1 李向麗 1 李曉璐 1* 中山火炬職業(yè)技術(shù)學(xué)院 廣東中山 528436

　　摘 要:以地塞米松為代表的糖皮質(zhì)激素非法添加現(xiàn)象,仍然是我國動(dòng)物源性食品安全的重要隱患。研究通過熒光微球免疫層析技術(shù),對(duì)地塞米松進(jìn)行了定量檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),所建立的地塞米松檢測(cè)方法IC50為0.87 ng/mL,線性范圍為0.1~8.4ng/mL(y =-0.18ln x+0.92,R2=0.99)。檢測(cè)組織樣本的最低檢出限為0.7μg/kg,平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<30%(n=6)。使用30%的甲醇水溶液能一步完成提取過程,平均回收率為78%。 

關(guān)鍵詞:地塞米松;定量;熒光微球;免疫層析

　　地塞米松(圖 1 a)作為一種長效的糖皮質(zhì)激素,具有良好的抗炎 \ 抗過敏作用,被廣泛用于動(dòng)物疾病治療。然而,一些 研究指出,地塞米松因其促進(jìn)動(dòng)物生產(chǎn)功能而被非法濫用。在一些功能食品、保健品甚至是一些中藥材中,不法商販通過非 法添加糖皮質(zhì)類激素,使消費(fèi)者在食用后短期內(nèi)出現(xiàn)一些積極作用,但若長期食用則會(huì)引起內(nèi)分泌失調(diào)、致畸、致癌、致突變、水腫、糖尿病等不良反應(yīng)。在化妝品方面,由于糖皮質(zhì)類激素可以抑制細(xì)胞增生,減少 5- 羥色胺的形成,從而對(duì)皮膚有一定的嫩白作用 。但在長期使用后,就會(huì)造成人體皮膚變薄、毛細(xì)血管擴(kuò)張和毛囊萎縮,輕度受害者會(huì)皮膚會(huì)恢復(fù)到使用前狀態(tài),中度受害者會(huì)出現(xiàn)激素依賴性皮炎癥狀,重度受害者則會(huì)造成更嚴(yán)重的后果,比如類固醇性糖尿病、骨壞死和骨質(zhì)疏松、精神失常、消化性潰瘍和高血壓等疾病。因此我國農(nóng)業(yè)部 235 號(hào)公告中對(duì)動(dòng)物組織中地塞米松的限量做了具體的規(guī)定:肌肉為 0.75μg/kg,肝臟為 2g/kg。

　　目前動(dòng)物組織中地塞米松的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法 [1]、氣相色譜 - 質(zhì)譜法 [2]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[3]。雖然色譜方法準(zhǔn)確性較高,然而儀器昂貴、操作繁瑣、環(huán)境要求高。農(nóng)產(chǎn)品由于流通時(shí)間短(往往只有數(shù)小時(shí)),檢測(cè)方法如果耗時(shí)較長將無法實(shí)現(xiàn)餐前攔截。因此,建立相對(duì)準(zhǔn)確、便宜、快速的地塞米松現(xiàn)場(chǎng)速測(cè)方法作為實(shí)驗(yàn)室確證方法的補(bǔ)充,有利于完善農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)初篩 - 確證的風(fēng)險(xiǎn)防控體系,保證農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全。

　　免疫層析檢測(cè)技術(shù)(Immunochromatographic Assay,ICA) 的快速發(fā)展為地塞米松的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供了良好的技術(shù)基 礎(chǔ)。然而現(xiàn)有的地塞米松免疫層析方法主要基于膠體金標(biāo)記,雖 然其能直接依靠肉眼觀察結(jié)果,但是靈敏度較差且定量不準(zhǔn)

確,對(duì)于檢測(cè)地塞米松這種具有低限量值的藥物有一定的不便性。并且地塞米松是具有限量值的藥物,因此需要在量上判斷 是否超標(biāo),而膠體金的定量結(jié)果偏差較大。合成熒光素作為免疫反應(yīng)的指示物能有效地提高免疫分析信號(hào),與膠體金標(biāo)記相 比靈敏度可提高 10 ~ 100 倍 [4]。然而,其容易光漂白且易被基質(zhì)干擾,目前成功的免疫檢測(cè)產(chǎn)品仍然較少。近年來興起的熒光微球(fluorescent microspheres,FM)納米材料為提高免疫層析靈敏度提供了新的解決方案,其通過將熒光素包裹在熒光微球中,避免了基質(zhì)和熒光素的近距離接觸,從而避免了熒光信號(hào)的淬滅 [5]。并且該類微球已經(jīng)商品化,批間穩(wěn)定,標(biāo)記方便。本研究采用熒光微球標(biāo)記的免疫層析技術(shù),實(shí)現(xiàn)了地塞米松的定量快速檢測(cè)。

　　1. 材料與方法

　　1.1 材料與試劑

　　硝酸纖維膜(NC 膜)、熒光硅球墊、樣品墊、吸水紙及 PVC 底板(美國 Millipore 公司);FluoSpheres? 氨基修飾的熒光微球(直徑 0.2 μm、激發(fā)波長 505 nm、發(fā)射波長 515 nm)(美國 Thermo 公司);糖皮質(zhì)激素類標(biāo)準(zhǔn)品(加拿大 TRC 公司)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。地塞米松羧基衍生物 (圖 1 b),地塞米松包被抗原(圖 1 c)和抗地塞米松單克隆抗體由深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院提供。

　　1.2 儀器與設(shè)備

　　圖片拍攝設(shè)備為華為榮耀 8, 攝像頭覆蓋美國 BIOTEK 540nm±25nm 濾光片;505nm LED 光源 臺(tái)灣光宏;XYZ3100 點(diǎn)膜儀(美國 Bio-Dot 公司);試紙條讀取儀(深圳市三方圓生物科技有限公司);Milli-Q 水處理系統(tǒng)(美國 Millipore 公司)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 地塞米松抗體 - 熒光微球偶聯(lián)物制備

　　將免疫微球,EDC,NHS按1:1:1的比例投料,并加入 1000 倍質(zhì)量的去離子水?；罨^夜后,離心去除上清加 入去 pH7.4 的 0.01M PBS 重懸。分別以抗體質(zhì)量比微球質(zhì)量 1:10、1:30、1:100、1:200 的投料比混合地塞米松抗體。反應(yīng) 12 小時(shí)后,離心去除上清液,加入復(fù)溶液(含 1% BSA、2% 蔗 糖、0.05% PEG 20000、0.1% proclin 300 的 pH7.4 0.01M PBS 溶 液)重懸抗體 - 熒光微球偶聯(lián)物。

　　1.3.3 熒光試紙條的制備

　　熒光試紙條結(jié)果如圖 2 所示。首先將樣本墊浸泡于 20 mmol/ L 磷酸緩沖液(pH 7.4,含 1.0% BSA,0.25% Tween-20、1% PVP K-40、0.5% PEG 40000 和 0.1% NaN3)中,于 60 °C干燥 2 h;將 地塞米松包被抗原(2.5 mg/mL)和羊抗鼠 IgG(0. 3 mg/mL)噴涂于 NC 膜上,分別作為 TTX 試紙條檢測(cè)線(T 線)和質(zhì)控線 (C 線),于 37 °C真空干燥 12 h。結(jié)合墊噴有 TTX 抗體偶聯(lián)熒光微球,室溫真空干燥 12 h。最后將吸水紙、NC 膜、結(jié)合墊和經(jīng)過預(yù)處理的樣本墊順序粘貼在 PVC 底板上,用自動(dòng)切條機(jī)切成 4 mm 寬的試紙條,室溫條件下真空干燥,備用。

　　1.3.4 定量曲線的建立

　　以 T 線熒光信號(hào) /C 線熒光信號(hào)(FIT/FIC)為縱坐標(biāo),地塞米松標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),使用 Origin 8.0 建立四參數(shù)擬合曲線。

　　1.3.5 方法添加回收率選取色譜確證為地塞米松陰性的肌肉和肝臟樣品,地塞米松加標(biāo)量為 1μg/kg 和 10μg/kg,放置過夜。取 1 g 均質(zhì)的動(dòng)物組織,加入 6mL 30% 甲醇水溶液(w/w),渦旋震蕩 2 min,2000g 離心 5min,取上清液 0.1 mL 滴加至熒光免疫層析試紙的樣品墊,10 min 后讀取結(jié)果。

　　1.3.6 真實(shí)樣品的方法比對(duì)

　　在市場(chǎng)組織采購樣品 100 份(肝臟和肉各 50 份),使用本研究建立的方法和國標(biāo) GB/T 20741-2006 畜禽肉中地塞米松殘留量測(cè)定液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜法所規(guī)定的方法進(jìn)行對(duì)照檢測(cè) [23]。

　　2. 結(jié)果與分析

　　2.1 抗體免疫微球標(biāo)記投料比

　　抗體和熒光微球的投料比是制備抗體熒光微球偶聯(lián)物的關(guān)鍵參數(shù)?？贵w加入過多,會(huì)導(dǎo)致單個(gè)微球上帶入過多的抗體,檢測(cè)方法的靈敏度下降。而抗體加入不足,會(huì)導(dǎo)致部分微球無法偶聯(lián)抗體,則免疫層析的背景過高,同樣也會(huì)導(dǎo)致靈敏度下降。本研究試驗(yàn)了 4 個(gè)梯度的投料比制備的抗體 - 熒光微球偶聯(lián)物。如圖 3 所示,抗體和熒光微球的投料比在 1:30 時(shí),熒光免疫層析最為靈敏。

　　2.2 免疫層析反應(yīng)時(shí)間

　　層析反應(yīng)時(shí)間是熒光免疫層析的另外一個(gè)重要參數(shù)。本研究用空白的蒸餾水和 1.6ng/mL 的地塞米松標(biāo)準(zhǔn)溶液做10min 動(dòng)態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)。如圖4所示,免疫層析反應(yīng)在8min時(shí)達(dá)到平衡,T 線的熒光值與 C 線的熒光比值不發(fā)生顯著變化。因此,該試紙?jiān)诜磻?yīng) 8min 后即可進(jìn)入熒光免疫層析掃描儀讀數(shù)。

　　2.3 熒光免疫層析方法參數(shù)

　　FluoSpheres 氨基修飾的熒光微球是 Thermo 公司的商品化微球。據(jù)張世偉等報(bào)道,該微球制備的抗體 - 熒光微球偶聯(lián)物在 6 個(gè)月常溫保存的熒光衰減< 40%,具有良好的穩(wěn)定性 [24]。根據(jù)微球說明書,該微球的激發(fā)范圍為 450-515nm,最佳激發(fā)波長為 505nm,發(fā)射波長為 505-580nm,最大發(fā)射波 長為 515nm。為避免激發(fā)和發(fā)色光源的波長交叉引起的高背景,本研究選用 505nm LED 光源作為激發(fā)光源,并覆蓋 495nm ±20nm 濾光片避免雜光,在光檢測(cè)器前覆蓋 540±25 nm 濾光片消除背景。圖 5 展示了在暗室下使用覆蓋 495nm ±20nm 濾 光片的 505nm LED 激發(fā),用手機(jī)攝像頭覆蓋 540±25 nm 濾光片的熒光微球免疫層析試紙條觀察結(jié)果。在 0.1ng/mL 地塞米松 可將試紙條 T 線熒光強(qiáng)度抑制到等同于 C 線,為該試紙的最低檢測(cè)靈敏度。在 8.4 ng/mL 時(shí) T 線幾乎不可見,為線性范圍的最高值。

基于上述條件,本研究采用免疫層析熒光讀數(shù)儀對(duì)該試紙條建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖 6),回歸方程為 y = - 0.18ln x + 0.92(R2= 0.99)。以線性范圍的最低點(diǎn) 0.1 ng/mL 乘以其樣本前處理稀釋倍數(shù) 7 得到其最低檢出限為 0.7 μg/kg。糖皮質(zhì)激素是一類結(jié) 構(gòu)相似的藥物家族,表 1 展示了該方法檢測(cè)其他糖皮質(zhì)激素的 交叉反應(yīng)。該方法與醋酸地塞米松、倍他米松、倍氯米松等地 塞米松類似物具有一定的交叉反應(yīng)。因此,在試紙條檢測(cè)的樣 品為陽性結(jié)果需要儀器確證時(shí),需要同時(shí)檢測(cè)表 1 所示有交叉反應(yīng)的藥物。

　　2.5 方法評(píng)價(jià)

　　糖皮質(zhì)激素屬于脂溶性化合物,傳統(tǒng)的免疫學(xué)檢測(cè)方法需要使用有機(jī)溶劑萃取,吹干,再用 PBS 復(fù)溶,前處理非常繁瑣,無法滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需要 [25]。本研究采用的熒光微球免疫層析方法具有良好的抗有機(jī)溶劑能力,可耐受 30% 的甲醇,因此可以使用 30% 的甲醇水進(jìn)行提取后直接進(jìn)行免疫分析,平均回收率可達(dá)到 78%(表 2)。本方法的在定量上的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和其他免疫學(xué)檢測(cè)方法總體相當(dāng),在 20%~30% 之間 [24]。本研究從市場(chǎng)上隨機(jī)購買肌肉和肝 臟樣品各 50 份,分別用本研究建立的方法和國家標(biāo)準(zhǔn) GB/T 20741- 2006 畜禽肉中地塞米松殘留量測(cè)定液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行比對(duì)檢驗(yàn)。本試紙條結(jié)果為地塞米松未檢出的 93 個(gè)樣本,國標(biāo)法也為地塞米松未檢出。本試紙檢測(cè)結(jié)果為陽性的 7 個(gè)樣本,有 3 個(gè)國 標(biāo)法為地塞米松未檢出,其中的一個(gè)檢出倍他米松,另外兩個(gè)不符合樣品原因不明。4 個(gè)熒光微球免疫層析法和國標(biāo)法均檢出的樣品定量對(duì)比如圖 6 所示。對(duì)于低含量的樣本,熒光微球免疫層析法的定量結(jié)果與國標(biāo)法的吻合度較好。對(duì)于高含量的樣本,由于甲醇水提取效率的原因,熒光微球免疫層析法的定量結(jié)果低于國標(biāo)法。然而,熒光微球免疫層析方法前處理簡(jiǎn)單,設(shè)備輕便易于攜帶,實(shí)驗(yàn) 環(huán)境要求低,作為現(xiàn)場(chǎng)定量方法,具有顯著的優(yōu)勢(shì)。

　　結(jié)語

　　以地塞米松為代表的糖皮質(zhì)激素非法添加現(xiàn)象,目前仍然是我國動(dòng)物源性食品安全的重要隱患。本研究將新型高靈敏度 熒光探針引入檢測(cè)地塞米松的免疫層析體系,建立的檢測(cè)熒光微球免疫檢測(cè)方法以商品化微球?yàn)闃?biāo)記物,制備方便,熒光信 號(hào)穩(wěn)定。配合簡(jiǎn)單的一步提取前處理方法,整個(gè)檢測(cè)過程僅需 15 min,且無需使用大型設(shè)備,提高了地塞米松免疫層析技術(shù) 的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性,最終建立針對(duì)食品及化妝品中地塞米松熒光免疫層析現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法。該技術(shù)方法的建立對(duì)提高地塞米松檢測(cè)效率、降低檢測(cè)成本等具有重要實(shí)際意義,并 為食品及化妝品中小分子污染物快速檢測(cè)方法提供新思路 , 從而彌補(bǔ)了動(dòng)物源性食品中地塞米松現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)的短板。

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